Железооксидные магнитные сорбенты как твердая биофункциональная матрица для индикации возбудителя чумы в иммуноферментном анализе
Вы здесь
В ходе исследования разработали и экспериментально оценили магнитные сорбенты (МС) на основе микрочастиц оксида железа для индикации Yersinia (Y.) pestis методом ИФА. Функционализацию частиц проводили двумя способами: прямой иммобилизацией поликлональных антител и с использованием анионного ПАВ (лаурилсульфата натрия). Установлено, что применение ПАВ обеспечивает формирование стабильного иммуноглобулинового слоя с эффективной экспозицией Fab-фрагментов, повышая чувствительность анализа до 1.104 м.к./мл. Таким образом, полученные магнитные иммуносорбенты (МИС) могут быть использованы для селективного концентрирования и чувствительного выявления Y. pestis, а также применяться в составе тест-систем для диагностики других бактериальных инфекций.
Комментарии - 7
Добрый день, Коллеги!
Спасибо за столь актуальный и интересный материал. В ходе прочтения материалов возникло несколько вопросов.
1. Каковы были критерии выбора именно гидроксида калия в качестве осадителя и метода осаждения при синтезе магнитных микрочастиц FeO?
2. Исследовалась ли специфичность полученных МИС 2? Проводились ли перекрестные реакции с другими бактериями рода Yersinia (например, Y. pseudotuberculosis) или иными близкородственными грамотрицательными патогенами для оценки вероятности ложноположительных результатов?
3. Оценивалась ли стабильность полученных магнитных иммуносорбентов (МИС 2) при хранении в различных условиях (температура, буфер) и возможность их многократного использования?
Здравствуйте, Владимир Михайлович! Очень приятно, что работа Вас заинтересовала. Буду рад ответить на вопросы.
1. В качестве щелочного осадителя использовали гидроксид калия по нескольким причинам. Мы проверяли в качестве подобного агента и NaOH и раствор аммиака NH4OH. Выходным параметром стало распределение частиц по размерам. Несмотря на то, что натрий гидрокс. и аммиак также выражают щелочные свойства, при их использовании наблюдалось формирование двух или более фракций с неравномерным распределением по размеру. Также выбирали технологические параметры, такие как температура, скорость перемешивания и время синтеза.
2. В данный момент проводятся дополнительные исследования аналитической специфичности полученного материала по отношению к возбудителям бруцеллеза, кишечных инфекций (сальмонелла, эшерихия) и туляремия. Да, были проведены первые этапы по изучению специфичности бактерий рода Yersinia, в частности к Y.enterocolitica и Y. pseudotuberculosis. Перекрестных реакций не наблюдалось.
3. Что касательно влияния условий хранения, на данный момент идет изучение срока годности (1 года-наблюдения) полученного сорбента. По первичным результатам, в течение 5 месяцев активность материала не упала. Оценку влияния pH и температуры пока не проверяли. По нашим прогнозам, граничный диапазон pH будет составлять от 5,8-8,2, т.к. выход за рамки этих значений будет сопровождаться изменением конфигурации белка (антител), что может привести к десорбции биолиганда с поверхности магнитной матрицы. Что касательно температуры, то экспозиция материала происходит при температуре +4 градуса, во избежание рисков контаминации посторонней микрофлорой. По прогнозам, верхний граничный порог температуры может составлять до 40°С, повышение выше 56°С также приведет к разрушению иммуносорбента ввиду денатурации белка при данной температуре.
3.2. Информацию по поводу многократности использования. Полученный сорбент (его фиксированный объем для одного теста) может быть использован единожды для одного анализа. Дело в том, что при постановке иммуноферментного анализа (ИФА), после конъюгации с положительной пробой, на поверхности сорбента возникает двойной иммунный комплекс (ядро сорбента)-антитело-антиген-антитело с меткой, который в последствии и детектируется. После "блокировки" свободных Fab-фрагментов лиганда (антитело) на поверхности сорбента, он уже не представляет диагностической ценности. В свою очередь, в дальнейшем предполагается набор для тест системы ИФА для 96 образцов в двукратной повторности, поэтому закладываемого сорбента будет достаточно для проведения повторных исследований.
Добрый день, Давид Гурамиевич! Спасибо за интересный доклад. В статье описано следующее: Функционализацию
частиц осуществляли двумя методами: прямой иммобилизацией антител (МИС 1) и иммобилизацией с использованием анионного ПАВ (МИС 2). Функциональные испытания показали, что немодифицированные микрочастицы обеспечивали детекцию Y. pestis при концентрациях не ниже 110^6 м.к./мл. Применение МИС 1 позволило снизить предел обнаружения до 110^5 м.к./мл. Эффективные результаты обеспечивали МИС 2, с чувствительностью до 110^4 м.к./мл. Не совсем понятно, что из себя представляют немодифицированные частицы, для которых был получен результат 110^6 м.к./мл?
Здравствуйте, Анастасия Сергеевна! Рад Вашему вопросу. Немодифицированные частицы - это обыкновенные микрочастицы FeO. В данном случае, сорбция возбудителя происходит в сложноконтролируемом порядке следующим образом: при конъюгации с пробой, микробные клетки физически адсорбируются на поверхности или в микропорах оксида железа. В результате имеем среднюю чувствительность и нулевую специфичность.
Спасибо за информативный доклад по Вашему исследованию! Безусловно исследования по развитию средств диагностики, тест-систем являются очень востребованными в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия.
1) Прорабатывали ли Вы вопрос использования других соединений в качестве магнитного сорбента? Есть ли результаты?
2) Могут ли результаты Вашего исследования отвечать на запросы государства по технологическому суверенитету (импортозамещение)? Если да, то в какой части?
Здравствуйте, Максим Владиславович! Рады Вашей заинтересованности нашего исследования!
1. Да, после получения результатов, представленных в данной работе, было принято решение по оптимизации технологии магнитосорбционных материалов с целью улучшения не только чувствительность ИФА, но и возможности адаптации к другим методам исследования. В данный момент проводятся исследования по разработке и оценки полислойных аффинных магнитных сорбентов, где в качестве ядра выступают микроразмерные формы (диаметр до 300 нм) смешанного оксида железа (Fe3O4). Путем оптимизации технологических параметров, а также формирования гетерослойного сорбента (структура ядро-оболочка) удается сконцентрировать и задетектировать возбудитель с концентрацией 1*103 м.к./мл. Также проводятся исследования на поиск не только возбудителя чумы, но и туляремии.
2. Да, изучив коммерческую составляющую подобных продуктов в России, установили, что существуют различного рода магнитные сорбенты для концентрирования в ПЦР и других молекулярных методах (масс-спектрометрия и д.р.). В частности, наиболее приближенными по идее и механизму являются продукты компании Silex. Проанализировав данную ситуацию обнаружили, что не так и много производственных предприятий направлены на реализацию подобных магнитных материалов, поэтому область рынка магнитных сорбентов еще не до конца заполнена. Разрабатываемые тест-системы могут стать одним из множества видов продукции подобных диагностических систем, которые отвечают одному из направлений научно-технологического развития Российской Федерации: "Переход к персонализированной, предиктивной и профилактической медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения. В том числе за счёт рационального применения лекарственных препаратов и использования генетических данных и технологий.". Поэтому подобные разработки на территории РФ могут выступать в качестве одного из возможных решений вопроса технологического суверенитета в области здравоохранения.
Благодарю за развёрнутый ответ! Успехов в Ваших исследованиях и разработках!